Alpha-amylase Inhibition Activity Of White Kidney
Transcript Of Alpha-amylase Inhibition Activity Of White Kidney
กิจกรรมการยับยั้งเอนไซม์แอลฟา-อะไมเลสของสารสกัดถั่วขาว
นางสาวจุฑารัตน์ มนสั วิยางกูร
วิทยานิพนธ์นี้เป็นส่วนหนึ่งของการศึกษาตามหลักสูตรปริญญาวิทยาศาสตรมหาบัณฑิต สาขาวิชาเทคโนโลยีอาหาร
มหาวิทยาลัยเทคโนโลยีสุรนารี ปีการศึกษา 2557
ALPHA-AMYLASE INHIBITION ACTIVITY OF WHITE KIDNEY BEAN (PHASEOLUS VULGARIS) EXTRACT
Jutarat Manatwiyangkool
A Thesis Submitted in Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Master of Science in Food Technology Suranaree University of Technology Academic Year 2014
ALPHA-AMYLASE INHIBITION ACTIVITY OF WHITE KIDNEY BEAN (Phaseolus vulgaris) EXTRACT
Suranaree University of Technology has approved this thesis submitted in partial fulfillment of the requirements for a Master’s Degree.
Thesis Examining Committee
(Asst. Prof. Dr. Sunanta Tongta) Chairperson
(Asst. Prof. Dr. Ratchadaporn Oonsivilai) Member (Thesis Advisor)
(Dr. Rungtiwa Wongsagonsup) Member
(Prof. Dr. Sukit Limpijumnong) Vice Rector for Academic Affairs and Innovation
(Prof. Dr. Suwayd Ningsanond) Dean of Institute of Agricultural
จุฑารัตน์ มนสั วยิ างกรู : กิจกรรมการยบั ย้งั เอนไซมแ์ อลฟา - อะไมเลสของสารสกดั ถวั่ ขาว (ALPHA-AMYLASE INHIBITION ACTIVITY OF WHITE KIDNEY BEAN (Phaseolus vulgaris) EXTRACT) อาจารยท์ ี่ปรึกษา : ผชู้ ่วยศาสตราจารย์ ดร.รัชฏาพร อุ่นศิวไิ ลย,์ 88 หนา้ .
ถวั่ ขาวประกอบดว้ ยสารยบั ย้งั แอลฟา-อะไมเลสที่มีโปรตีนเป็ นส่วนประกอบ ซ่ึงรบกวน การย่อยคาร์โบไฮเดรตเชิงซ้อน กลุ่มเอนไซม์-สารยับย้ังสามารถลดพลังงานที่ได้รับจาก คาร์โบไฮเดรต ลดการหลงั่ อินซูลินและยบั ย้งั การหลั่งน้าย่อยโพลีเปปไทด์ของกระเพาะอาหาร วิทยานิพนธ์น้ีนาเสนอการศึกษาและออกแบบวิธีการที่เหมาะสมในการสกดั สารยบั ย้งั เอนไซม์ แอลฟา-อะไมเลสจากถวั่ ขาว ผลการทดลองแสดงค่าโปรตีนสูงสุดที่ 6.49±0.09 มิลลิกรัมต่อกรัม ของถวั่ ขาวและมีค่าเฉพาะกิจกรรมยบั ย้งั เอนไซม์ แอลฟา-อะไมเลสที่ 34.69±0.56 ต่อมิลลิกรัมของ โปรตีนในสารสกดั หยาบ ปริมาณผลผลิตของสารสกดั ถวั่ ขาวสูงที่สุดคือ 23.32 เปอร์เซ็นตซ์ ่ึงไดจ้ าก สภาวะการสกดั ที่ความเขม้ ขน้ 0.15 โมลาร์ของสารละลายฟอตเฟตบฟั เฟอร์ ในการสกดั 2 ชวั่ โมง และการแยกตวั 60 นาที อย่างไรก็ตามค่าเฉพาะเจาะจงในการยบั ย้งั กิจกรรมของเอนไซม์แอลฟาอะไมเลสสูงที่สุดเกิดข้ึนโดยสภาวะการสกดั ที่ความเขม้ ขน้ 0.08 โมลาร์ของสารละลายฟอตเฟต บฟั เฟอร์ ในการสกดั 1.5 ชวั่ โมงและการแยกตวั 30 นาที
สารสกดั ถวั่ ขาวที่ได้จากสภาวะที่เหมาะสม มีค่าเฉพาะเจาะจงในการยบั ย้งั กิจกรรมของ เอนไซม์แอลฟา-อะไมเลสสูงที่สุด เมื่อเปรียบเทียบกบั สารสกดั ทางการคา้ หลงั จากผ่านระบบการ ยอ่ ยพบวา่ สารสกดั ถวั่ ขาวที่ไดแ้ ละสารสกดั ทางการคา้ มีค่าเฉพาะเจาะจงในการยบั ย้งั กิจกรรมของ เอนไซม์แอลฟา-อะไมเลสลดลง นอกจากน้ีรูปแบบของโพลีเปปไทของสารสกัดถั่วขาวท้งั สอง ใกลเ้ คียงกนั
สาขาวชิ าเทคโนโลยอี าหาร ปี การศึกษา 2557
ลายมือชื่อนกั ศึกษา ลายมือชื่ออาจารยท์ ี่ปรึกษา
II
JUTARAT MANATWIYANGNKOOL : ALPHA - AMYLASE INHIBITION ACTIVITY OF WHITE KIDNEY BEAN (Phaseolus vulgaris) EXTRACT. THESIS ADVISOR : ASST. PROF. RATCHADAPORN OONSIVILAI, Ph.D., 88 PP.
ALPHA - AMYLASE INHIBITION ACTIVITY OF WHITE KIDNEY BEAN (Phaseolus vulgaris) EXTRACT
White kidney beans (Phaseolus vulgaris) contain proteinaceous inhibitors of α-amylase which can interfere with complex carbohydrate digestion. The enzymeinhibitor complex would reduce energy obtained from carbohydrate, reduce insulin, and reduce gastric inhibitory polypeptide secretion. This study aimed to discover a suitable extraction method for α-amylase inhibition from white kidney bean. The results showed that the highest protein content was 6.49±0.09 mg/g of beans and α-amylase specific inhibition activity was 34.69±0.56 per mg of protein of the crude extract. The highest yield of the extract was 23.32% obtained from the extraction condition at 0.15 M Phosphate buffer saline, extraction time for 2 hr, and separation 60 min. Moreover, The highest α-amylase specific inhibition activity of the extract was optimized at 0.08 M Phosphate buffer saline, 1.5 hr extraction, and 30 min separation.
The white kidney bean extract from the optimized condition had the best αamylase specific inhibition activity when compared with the commercial white kidney bean extract. After in vitro digestion, the α-amylase specific inhibition activity of the
III
white kidney bean extract and the commercial white kidney bean extract was decreased. In addition, the polypeptide pattern of both extracts was similar.
School of Food Technology Academic Year 2014
Student’s Signature Advisor’s Signature
ACKNOWLEDGEMENT
I would like to express my sincere thanks to my thesis advisor, Assist. Prof. Dr. Ratchadaporn Oonsivilai for her invaluable help and constant encouragement throughout the course of this research. I am most grateful for her teaching and advice, not only the research methodologies but also many other methodologies in life. I would not have achieved this far and this thesis would not have been completed without all the support that I have always received from her.
I am indebted to all my friends at the School of Food Technology, Suranaree University of Technology for their scientific discussion friendships, and helps throughout my staying period.
Most importantly, I would like to thank my family for their support and faith in me. They have always been a great source of inspiration to take on any challenge in life. I dedicate this thesis to them.
Jutarat Manatwiyangkool
CONTENTS
Page
ABSTRACT (THAI).…….……………………………………………………………..I ABSTRACT (ENGLISH).…….………………………………………………………III ACKNOWLEDGEMENTS.…………………………………………………… …V CONTENTS….……………………………………………………………………….VI LIST OF TABLES.….………………………………………………………...……….X LIST OF FIGURES.…………………………………………………………………..XI SYMBOLS AND ABBREVIATIONS……………………………………...……...XIV CHAPTER
I INTRODUCTION….…………………….………………………....1 1.1 Introduction …………………………………………………..1 1.2 Research Objective.…………………………………………….6 1.3 Research hypothesis….…………………………………...……6 1.4 Scope and limitation of the study ………………………….6 1.5 Expected results ………………………………………………..6
II LITERATURE REVIEW.…….……………………………………7 2.1 White kidney bean (Phaseolus vulgaris) ………………………7 2.2 α-Amylase ………………………..…………………………..9 2.3 Alpha-amylase inhibitors (αAI).………………………………12 2.4 Relationship between alpha amylase source and alpha amylase enzyme inhibitor activity…………………16
VII
CONTENTS (Continued)
Page
2.5 Relationship between seed color of beans and α-amylase inhibitor activity.…………………………….…….18
2.6 Effect of pH on α-amylase inhibitor activity …………………18 2.7 Effect of salts on α-amylase inhibitor activity ……….……….21 2.8 Temperature effect on α-amylase inhibitor activity…………..22 2.9 Inhibitors of Amylase Action.…………………………….…..24 2.10 Effect of white kidney bean extract for diabetes prevention …24 2.11 The effect of white kidney bean extract for
body weight control.………………………………….……….25 2.12 Stability.……………………………………………….………29 2.13 Toxicological studies.……………………………….………...31 2.14 In vitro and in vivo studies on the digestibility ………….…...32 2.15 Response surface methodology.………………………………34 2.16 Extraction of proteinaceous α-amylase inhibitor ….……….…36 2.17 Electrophoretic methods…….………………………….……..42 III MATERIALS AND METHODS ….……………………………...44 3.1 Materials…..………….……………………………………….44 3.2 Proximate analysis….…………………………………..……..44 3.3 Selection and modification extraction method ….………..…..48
3.3.1 Mosca and et al. (2008) ……………...………...……..48
VIII
CONTENTS (Continued)
Page
3.3.2 Marshall and Lauda method (1975) …..………………48 3.3.3 Le Berrre-Anton et al. (1997) .………………………..49 3.3.4 Giri et al. (1996)………………………..……………..49 3.3.5 Grant et al. (1995) …………………….…….………...49 3.4 Protein concentration ……………………..…………………..49 3.5 Enzyme assays ………………………………………………..50 3.5.1 Specific inhibition activity.…………………………...50 3.5.2 -amylase activity ……………………………..……..51 3.5.3 -amylase inhibitor activity.………….……………....51 3.6 Yield of extract.……………………………………..………...51 3.7 Optimization extraction.………………………………………51 3.8 Statistical analysis ……………………………………….……52 3.9 Electrophoresis……………………………………….……….53 3.10 In vitro digestion.………………………………………..…….53 IV RESULT AND DISCUSSION.……………………………………54 4.1 Proximate composition.……………………………………….54 4.2 Selection and modification extraction method …..…….……..55 4.3 Optimization extraction method …………...………….……...57 4.4 Gel electrophoresis…...….……………………………………64 V CONCLUSION…………….………………………………………66
นางสาวจุฑารัตน์ มนสั วิยางกูร
วิทยานิพนธ์นี้เป็นส่วนหนึ่งของการศึกษาตามหลักสูตรปริญญาวิทยาศาสตรมหาบัณฑิต สาขาวิชาเทคโนโลยีอาหาร
มหาวิทยาลัยเทคโนโลยีสุรนารี ปีการศึกษา 2557
ALPHA-AMYLASE INHIBITION ACTIVITY OF WHITE KIDNEY BEAN (PHASEOLUS VULGARIS) EXTRACT
Jutarat Manatwiyangkool
A Thesis Submitted in Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Master of Science in Food Technology Suranaree University of Technology Academic Year 2014
ALPHA-AMYLASE INHIBITION ACTIVITY OF WHITE KIDNEY BEAN (Phaseolus vulgaris) EXTRACT
Suranaree University of Technology has approved this thesis submitted in partial fulfillment of the requirements for a Master’s Degree.
Thesis Examining Committee
(Asst. Prof. Dr. Sunanta Tongta) Chairperson
(Asst. Prof. Dr. Ratchadaporn Oonsivilai) Member (Thesis Advisor)
(Dr. Rungtiwa Wongsagonsup) Member
(Prof. Dr. Sukit Limpijumnong) Vice Rector for Academic Affairs and Innovation
(Prof. Dr. Suwayd Ningsanond) Dean of Institute of Agricultural
จุฑารัตน์ มนสั วยิ างกรู : กิจกรรมการยบั ย้งั เอนไซมแ์ อลฟา - อะไมเลสของสารสกดั ถวั่ ขาว (ALPHA-AMYLASE INHIBITION ACTIVITY OF WHITE KIDNEY BEAN (Phaseolus vulgaris) EXTRACT) อาจารยท์ ี่ปรึกษา : ผชู้ ่วยศาสตราจารย์ ดร.รัชฏาพร อุ่นศิวไิ ลย,์ 88 หนา้ .
ถวั่ ขาวประกอบดว้ ยสารยบั ย้งั แอลฟา-อะไมเลสที่มีโปรตีนเป็ นส่วนประกอบ ซ่ึงรบกวน การย่อยคาร์โบไฮเดรตเชิงซ้อน กลุ่มเอนไซม์-สารยับย้ังสามารถลดพลังงานที่ได้รับจาก คาร์โบไฮเดรต ลดการหลงั่ อินซูลินและยบั ย้งั การหลั่งน้าย่อยโพลีเปปไทด์ของกระเพาะอาหาร วิทยานิพนธ์น้ีนาเสนอการศึกษาและออกแบบวิธีการที่เหมาะสมในการสกดั สารยบั ย้งั เอนไซม์ แอลฟา-อะไมเลสจากถวั่ ขาว ผลการทดลองแสดงค่าโปรตีนสูงสุดที่ 6.49±0.09 มิลลิกรัมต่อกรัม ของถวั่ ขาวและมีค่าเฉพาะกิจกรรมยบั ย้งั เอนไซม์ แอลฟา-อะไมเลสที่ 34.69±0.56 ต่อมิลลิกรัมของ โปรตีนในสารสกดั หยาบ ปริมาณผลผลิตของสารสกดั ถวั่ ขาวสูงที่สุดคือ 23.32 เปอร์เซ็นตซ์ ่ึงไดจ้ าก สภาวะการสกดั ที่ความเขม้ ขน้ 0.15 โมลาร์ของสารละลายฟอตเฟตบฟั เฟอร์ ในการสกดั 2 ชวั่ โมง และการแยกตวั 60 นาที อย่างไรก็ตามค่าเฉพาะเจาะจงในการยบั ย้งั กิจกรรมของเอนไซม์แอลฟาอะไมเลสสูงที่สุดเกิดข้ึนโดยสภาวะการสกดั ที่ความเขม้ ขน้ 0.08 โมลาร์ของสารละลายฟอตเฟต บฟั เฟอร์ ในการสกดั 1.5 ชวั่ โมงและการแยกตวั 30 นาที
สารสกดั ถวั่ ขาวที่ได้จากสภาวะที่เหมาะสม มีค่าเฉพาะเจาะจงในการยบั ย้งั กิจกรรมของ เอนไซม์แอลฟา-อะไมเลสสูงที่สุด เมื่อเปรียบเทียบกบั สารสกดั ทางการคา้ หลงั จากผ่านระบบการ ยอ่ ยพบวา่ สารสกดั ถวั่ ขาวที่ไดแ้ ละสารสกดั ทางการคา้ มีค่าเฉพาะเจาะจงในการยบั ย้งั กิจกรรมของ เอนไซม์แอลฟา-อะไมเลสลดลง นอกจากน้ีรูปแบบของโพลีเปปไทของสารสกัดถั่วขาวท้งั สอง ใกลเ้ คียงกนั
สาขาวชิ าเทคโนโลยอี าหาร ปี การศึกษา 2557
ลายมือชื่อนกั ศึกษา ลายมือชื่ออาจารยท์ ี่ปรึกษา
II
JUTARAT MANATWIYANGNKOOL : ALPHA - AMYLASE INHIBITION ACTIVITY OF WHITE KIDNEY BEAN (Phaseolus vulgaris) EXTRACT. THESIS ADVISOR : ASST. PROF. RATCHADAPORN OONSIVILAI, Ph.D., 88 PP.
ALPHA - AMYLASE INHIBITION ACTIVITY OF WHITE KIDNEY BEAN (Phaseolus vulgaris) EXTRACT
White kidney beans (Phaseolus vulgaris) contain proteinaceous inhibitors of α-amylase which can interfere with complex carbohydrate digestion. The enzymeinhibitor complex would reduce energy obtained from carbohydrate, reduce insulin, and reduce gastric inhibitory polypeptide secretion. This study aimed to discover a suitable extraction method for α-amylase inhibition from white kidney bean. The results showed that the highest protein content was 6.49±0.09 mg/g of beans and α-amylase specific inhibition activity was 34.69±0.56 per mg of protein of the crude extract. The highest yield of the extract was 23.32% obtained from the extraction condition at 0.15 M Phosphate buffer saline, extraction time for 2 hr, and separation 60 min. Moreover, The highest α-amylase specific inhibition activity of the extract was optimized at 0.08 M Phosphate buffer saline, 1.5 hr extraction, and 30 min separation.
The white kidney bean extract from the optimized condition had the best αamylase specific inhibition activity when compared with the commercial white kidney bean extract. After in vitro digestion, the α-amylase specific inhibition activity of the
III
white kidney bean extract and the commercial white kidney bean extract was decreased. In addition, the polypeptide pattern of both extracts was similar.
School of Food Technology Academic Year 2014
Student’s Signature Advisor’s Signature
ACKNOWLEDGEMENT
I would like to express my sincere thanks to my thesis advisor, Assist. Prof. Dr. Ratchadaporn Oonsivilai for her invaluable help and constant encouragement throughout the course of this research. I am most grateful for her teaching and advice, not only the research methodologies but also many other methodologies in life. I would not have achieved this far and this thesis would not have been completed without all the support that I have always received from her.
I am indebted to all my friends at the School of Food Technology, Suranaree University of Technology for their scientific discussion friendships, and helps throughout my staying period.
Most importantly, I would like to thank my family for their support and faith in me. They have always been a great source of inspiration to take on any challenge in life. I dedicate this thesis to them.
Jutarat Manatwiyangkool
CONTENTS
Page
ABSTRACT (THAI).…….……………………………………………………………..I ABSTRACT (ENGLISH).…….………………………………………………………III ACKNOWLEDGEMENTS.…………………………………………………… …V CONTENTS….……………………………………………………………………….VI LIST OF TABLES.….………………………………………………………...……….X LIST OF FIGURES.…………………………………………………………………..XI SYMBOLS AND ABBREVIATIONS……………………………………...……...XIV CHAPTER
I INTRODUCTION….…………………….………………………....1 1.1 Introduction …………………………………………………..1 1.2 Research Objective.…………………………………………….6 1.3 Research hypothesis….…………………………………...……6 1.4 Scope and limitation of the study ………………………….6 1.5 Expected results ………………………………………………..6
II LITERATURE REVIEW.…….……………………………………7 2.1 White kidney bean (Phaseolus vulgaris) ………………………7 2.2 α-Amylase ………………………..…………………………..9 2.3 Alpha-amylase inhibitors (αAI).………………………………12 2.4 Relationship between alpha amylase source and alpha amylase enzyme inhibitor activity…………………16
VII
CONTENTS (Continued)
Page
2.5 Relationship between seed color of beans and α-amylase inhibitor activity.…………………………….…….18
2.6 Effect of pH on α-amylase inhibitor activity …………………18 2.7 Effect of salts on α-amylase inhibitor activity ……….……….21 2.8 Temperature effect on α-amylase inhibitor activity…………..22 2.9 Inhibitors of Amylase Action.…………………………….…..24 2.10 Effect of white kidney bean extract for diabetes prevention …24 2.11 The effect of white kidney bean extract for
body weight control.………………………………….……….25 2.12 Stability.……………………………………………….………29 2.13 Toxicological studies.……………………………….………...31 2.14 In vitro and in vivo studies on the digestibility ………….…...32 2.15 Response surface methodology.………………………………34 2.16 Extraction of proteinaceous α-amylase inhibitor ….……….…36 2.17 Electrophoretic methods…….………………………….……..42 III MATERIALS AND METHODS ….……………………………...44 3.1 Materials…..………….……………………………………….44 3.2 Proximate analysis….…………………………………..……..44 3.3 Selection and modification extraction method ….………..…..48
3.3.1 Mosca and et al. (2008) ……………...………...……..48
VIII
CONTENTS (Continued)
Page
3.3.2 Marshall and Lauda method (1975) …..………………48 3.3.3 Le Berrre-Anton et al. (1997) .………………………..49 3.3.4 Giri et al. (1996)………………………..……………..49 3.3.5 Grant et al. (1995) …………………….…….………...49 3.4 Protein concentration ……………………..…………………..49 3.5 Enzyme assays ………………………………………………..50 3.5.1 Specific inhibition activity.…………………………...50 3.5.2 -amylase activity ……………………………..……..51 3.5.3 -amylase inhibitor activity.………….……………....51 3.6 Yield of extract.……………………………………..………...51 3.7 Optimization extraction.………………………………………51 3.8 Statistical analysis ……………………………………….……52 3.9 Electrophoresis……………………………………….……….53 3.10 In vitro digestion.………………………………………..…….53 IV RESULT AND DISCUSSION.……………………………………54 4.1 Proximate composition.……………………………………….54 4.2 Selection and modification extraction method …..…….……..55 4.3 Optimization extraction method …………...………….……...57 4.4 Gel electrophoresis…...….……………………………………64 V CONCLUSION…………….………………………………………66