Synthesis and biological evaluation of C-nucleoside analogues

Preparing to load PDF file. please wait...

0 of 0
Synthesis and biological evaluation of C-nucleoside analogues

Transcript Of Synthesis and biological evaluation of C-nucleoside analogues

KU Leuven Groep Biomedische Wetenschappen Faculteit Farmaceutische Wetenschappen Rega Institute for Medical Research Laboratorim van Medicinale Chemie

Synthesis and biological evaluation of C-nucleoside analogues
Peng Nie

Promotor: Prof. Piet Herdewijn
Co-Promotor: Dr. Elisabetta Groaz Dr. Steven De Jonghe

Proefschrift voorgedragen tot het behalen van de graad van Doctor in de Farmaceutische Wetenschappen

September 2019

KU Leuven Biomedical Sciences Group Faculty of Pharmaceutical Research Rega Institute for Medical Research Laboratory of Medicinal Chemistry

Synthesis and biological evaluation of C-nucleoside analogues
Peng Nie


Promoter: Co-Promoter:
Chair: Jury members:

Prof. Piet Herdewijn Dr. Elisabetta Groaz Dr. Steven De Jonghe Prof. Jef Rozenski Prof. Graciela Andrei Prof. Wim Dehaen Prof. Johan Van der Eycken Prof. Raphael Frédérick

Dissertation presented in partial fulfilment of the requirements for the degree of Doctor in Pharmaceutical Sciences

September 2019

I would like to thank all the people who helped me from the bottom of my heart. These four years’ memory at the Rega Institute will never fade away.
First of all, I would like to thank my promoter Prof. Piet Herdewijn for offering me the opportunity to work in his group, his guidance during my PhD project in the research area of nucleosides. All I have learned from him is invaluable: the knowledge about nucleosides, the rigorous attitude towards science and the enthusiasm for research. I am also indebted to my co-promotors Dr. Elisabetta Groaz and Dr. Steven De Jonghe for their constant help along this journey. Thanks to Dr. Elisabetta Groaz for her kind help in revising the papers and thesis and Dr. Steven De Jonghe for kindly revising this thesis and translating the summary into Dutch.
I would like to give my special thanks to all the jury members Prof. Jef Rozenski, Prof. Wim Dehaen, Prof. Graciela Andrei, Prof. Raphaël Frédérick, and Prof. Johan Van der Eycken for accepting to be a member of the evaluating committee and their scientific questions and suggestions during my doctoral studies and the preparation of this thesis manuscript.
I thank our scientific collaborators for their support in our study: Prof. Graciela Andrei and Prof. Johan Neyts for antiviral evaluation of our compounds; Prof. Dirk Daelemans for antitumoral evaluation.
I am grateful to Prof. Jef Rozenski for providing mass spectroscopy measurement and Prof. Eveline Lescrinier for helpful discussion about NMR assignment. I thank Luc Baudemprez for recording the 500 and 600 MHz NMR spectra and his technical assistance for arranging lab equipment.
I thank all the secretaries Chantal Biernaux, Christiane Callebaut, Dominique Brabants, Inge Aerts, Cathy De Meyer and Patrick Briers for their excellent secretarial work and a special thanks to Chantal for her editorial help during paper publication.
Thanks to all my colleagues in the laboratory of Medicinal Chemistry for their scientific help and discussion, and for being such nice and supportive co-workers.

Many thanks to my friends and colleagues Min Luo, Chao Liu, Xiaochen Li, Mengmeng Wang and Qingfeng Li for their kind help and support. There are no words to describe my love for my family. Thanks for their blessings and constant support at every stage of my life. I would like to give my unending love and thanks to my girlfriend, Dan Li, who listens to me and tolerates me all the time. I thank all my friends who have always been around. Thank you for making these four years joyful with holidays and delicious Chinese food. I am also thankful to the China Scholarship Council (CSC) for providing the doctoral scholarship.
Peng Nie Leuven, 2019

C-Nucleosides are an important family of compounds with promising biological activities. In C-nucleosides, the labile C-N glycosidic linkage of classical N-nucleosides is replaced by a more stable C-C bond, which makes C-nucleosides resistant against hydrolysis. Some naturally occurring C-nucleosides such as formycin and showdomycin are potent antibiotics, while pseudouridine, an isomer of uridine, is able to stabilize RNA duplexes by replacing uridine. A number of synthetic C-nucleosides display potent antiviral activity. The most significant examples are BCX4430 (galidesivir) and GS-5734 (remdesivir), which are both currently being developed as drugs for the treatment of Ebola virus (EBOV) infections.
Nucleoside phosphonates are isosteres of nucleoside monophosphates, in which the labile P-O bond is substituted by a stable P-C bond. Hence, nucleoside phosphonates possess an improved metabolic stability against phosphatase-catalyzed hydrolysis. In addition, the presence of a phosphonate moiety allows to skip the first phosphorylation step that is required for nucleoside activation. The most successful examples of nucleoside phosphonates are acyclic nucleoside phosphonates, such as adefovir, tenofovir, and cidofovir, which received marketing approval as antiviral drugs.
The main goal of this Ph.D. thesis was to investigate the chemical and biological properties of novel C-nucleosides as well as C-nucleoside phosphonates. To this aim, 9-deazaadenine and pyrrolo[2,1-f][1,2,4]triazin-4-amine were selected as nucleobases, based on their promising biological profile.
In the first part of this thesis (Chapter 2), the synthesis and antiviral evaluation of a 5’phosphonate-C-nucleoside with 9-deazaadenine as nucleobase is described. The initial introduction of a phosphonate moiety onto a benzoyl protected 5’-acetoxy-[2’S]-9deazaadenosine derivative was unsatisfactory, since an unexpected epimerization at the 2’position occurred upon removal of the benzoyl groups under basic conditions. However, an efficient synthetic route was established through the stereoselective installation of the phosphonomethoxy group at the anomeric 5’-position of [5’R]-acetoxy-[2’R]-9deazaadenosine, followed by a base-promoted epimerization reaction to provide the desired [2’S] compound. Such C-nucleoside phosphonate and its prodrug were submitted for antiviral

evaluation against a panel of RNA viruses such as RSV, Zika virus, Influenza A H1N1, Polio virus, and MERS coronavirus. Unfortunately, no significant antiviral activity or cytotoxicity was observed.
To further study the properties of 5’-phosphonate-C-nucleosides, a 3’-deoxy derivative and its corresponding phosphonoamidate prodrug were synthesized, as discussed in Chapter 3. The 2’-deoxy-9-deazaadenosine derivative was prepared from a 2’-bromo intermediate via reduction under Barton-McCombie deoxygenation conditions. The target 5’-phosphonate-3’deoxy-C-nucleoside was then obtained by a base-promoted epimerization reaction as established in Chapter 2. The assessment of the antiviral activity of this 5’-phosphonate-3’deoxy-C-nucleoside and its prodrug against a number of DNA viruses (including HSV, CMV, and VZV) revealed that they completely lacked antiviral activity and cytotoxicity.
In Chapter 4, the synthesis and antiproliferative evaluation of xylo-C-nucleosides containing pyrrolo[2,1-f][1,2,4]triazin-4-amine as nucleobase are described. The synthesis started with the coupling between a benzyl protected D-xylono-1,4-lactone and 4-(methylthio)pyrrolo[2,1f][1,2,4]triazine under basic conditions. A survey of several reaction conditions for the deprotection of the benzyl groups revealed that a palladium-catalyzed hydrogen transfer reaction allowed to isolate the target compound in good yield. An in vitro antiproliferative assay showed that this xylo-C-nucleoside was active against a panel of tumor cell lines such as the human leukemia HL-60 (IC50 = 1.9 µM) and lung cancer NCI-H460 (IC50 = 2.0 µM) cells.
To extend the scope of our study in the field of C-nucleoside phosphonates, the synthesis of a L-threose C-nucleoside with a phosphonomethoxy moiety at the 3’-position and pyrrolo[2,1f][1,2,4]triazin-4-amine as nucleobase is described in Chapter 5. This C-nucleoside was obtained by coupling a benzyl protected L-threono-1,4-lactone with 4-(methylthio)pyrrolo[2,1f][1,2,4]triazine. A tert-butyldiphenylsilyl group was selected for the regioselective protection of the 3’-hydroxyl group and then cleaved to give the key intermediate with a free hydroxyl group at the 3’-position. A phosphonate unit was successfully introduced under basic conditions to give the desired compound. Unfortunately, antiviral evaluation against RNA viruses and DNA viruses revealed that the synthesized threose C-nucleosides exhibited no significant antiviral activity or cytotoxicity. Further screening against HBV is currently undergoing.

C-Nucleosiden zijn een belangrijke groep van verbindingen met veelbelovende biologische activiteit. Bij C-nucleosiden wordt de labiele C-N glycosidische binding van de klassieke Nnucleosiden vervangen door een stabiele C-C binding, waardoor C-nucleosiden bestand zijn tegen hydrolyse. Een aantal natuurlijk voorkomende C-nucleosiden zoals bijvoorbeeld formycin en showdomycin zijn potente antibiotica, terwijl pseudouridine, een isomeer van uridine, in staat is om RNA-duplexen te stabiliseren. Een aantal synthetische C-nucleosiden bezitten potente antivirale eigenschappen. De meest gekende voorbeelden zijn BCX4430 (galidesivir) en GS-5734 (remdesivir), die momenteel beiden in klinische ontwikkeling zijn voor de behandeling van Ebola virus (EBOV) infecties.
Nucleoside fosfonaten zijn isosteren van nucleoside monofosfaten, waarbij de labiele P-O binding werd vervangen door een stabiele P-C binding. Als gevolg hiervan zijn nucleoside fosfonaten metabool stabiel en zijn ze niet langer gevoelig aan fosfatase-gekatalyseerde hydrolyse. De aanwezigheid van de fosfonaat groep heeft daarenboven als voordeel dat de eerste fosforylatie, die nodig is in het activeringproces van een antiviraal actief nucleoside, kan omzeild worden. Acyclische nucleoside fosfonaten zijn de meest succesvolle voorbeelden van nucleoside fosfonaten. Gekende voorbeelden zijn adefovir, tenofovir en cidofovir, die allen gecommercialiseerd werden als antivirale geneesmiddelen.
Het doel van dit doctoraatswerk was om de chemische en biologische eigenschappen van nieuwe C-nucleosiden en C-nucleoside fosfonaten te onderzoeken. Als nucleobasen werden hiertoe 9-deazaadenine en pyrrolo[2,1-f][1,2,4]triazin-4-amine geselecteerd.
In het eerste deel van deze doctoraatsthesis (Hoofdstuk 2) werd de synthese en antivirale evaluatie van een 5’-fosfonaat-C-nucleoside met 9-deazaadenine als nucleobase beschreven. Een fosfonaat groep werd ingevoerd op een benzoyl beschermd 5’-acetoxy-[2’S]-9deazaadenosine. Tijdens ontscherming van deze benzoyl schermgroep in basische omstandigheden greep een onverwachte epimerisatie plaats op de 2’-positie. Daarom werd er een efficiëntere syntheseroute ontwikkeld via de stereoselective invoering van de fosfonomethoxy groep op de anomere 5’-positie van [5’R]-acetoxy-[2’R]-9-deazaadenosine, gevolgd door een base-geïnduceerde epimerisatie reactie, wat uiteindelijk het gewenste [2’S]

derivaat opleverde. Dit C-nucleoside fosfonaat, alsook de corresponderende prodrug, werden geëvalueerd voor hun antivirale eigenschappen tegen een panel van RNA virussen zoals RSV, Zika virus, Influenza A H1N1, Polio virus en MERS coronavirus. Spijtig genoeg werd geen antivirale activiteit, noch cytotoxiciteit, waargenomen.
Om de eigenschappen van 5’-fosfonaat-C-nucleosiden verder te bestuderen werd ook een 3’deoxy derivaat en de corresponderende fosfonoamidate prodrug bereid (Hoofdstuk 3). Het 2’deoxy-9-deazaadenosine derivaat werd gesynthetiseerd uit een 2’-bromo intermediair via een Barton-McCombie reductie. Het gewenste 5’-fosfonaat-3’-deoxy-C-nucleoside werd uiteindelijk bekomen via een base-geïnduceerde epimerisatie, zoals deze die op punt werd gesteld in Hoofdstuk 2. Het testen van dit 5’-phosphonate-3’-deoxy-C-nucleoside en zijn prodrug tegen een aantal DNA virussen (zoals HSV, CMV en VZV) leverde geen noemenswaardige antivirale activiteit of cytotoxiciteit op.
In Hoofdstuk 4 werden de synthese en antitumorale evaluatie van xylo-C-nucleosiden met een pyrrolo[2,1-f][1,2,4]triazin-4-amine als nucleobase beschreven. De synthese begon met de koppeling van een benzyl beschermd D-xylono-1,4-lactone en 4-(methylthio)pyrrolo[2,1f][1,2,4]triazine onder basische omstandigheden. Verschillende reactiecondities voor de ontscherming van de benzyl groupen werden uitgeprobeerd en een palladium-gekatalyseerde waterstoftransfer reactie liet ons toe om de gewenste verbinding te isoleren in een goed rendement. Het onderzoek naar de antiproliferatieve eigenschappen van deze verbinding toonde aan dat dit xylo-C-nucleoside antitumorale activiteit vertoonde in een aantal kanker cellijnen zoals de humane leukemie HL-60 cellijn (IC50 = 1.9 µM) en de longkanker cellijn NCI-H460 (IC50 = 2.0 µM).
Om het studieterrein van de C-nucleoside fosfonaten verder te bestuderen werd tenslotte de synthese van een L-threose C-nucleoside met een fosfonomethoxy groep op de 3’-positie en een pyrrolo[2,1-f][1,2,4]triazin-4-amine als nucleobase uitgevoerd, zoals beschreven in Hoofdstuk 5. Dit C-nucleoside werd bekomen via een koppeling tussen een benzyl beschermd L-threono-1,4-lactone en 4-(methylthio)pyrrolo[2,1-f][1,2,4]triazine. Er werd geopteerd voor een tert-butyldifenylsilyl groep voor de regioselectieve bescherming van de 3’-hydroxyl groep, die dan op een later stadium van de synthese terug werd afgesplitst om aldus een